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Bioinformática Aplicada à Imunologia

Análise de Repertório (AIRR-Seq)

Sequenciamento de repertório de receptores de imunidade adaptativa (do inglês, Adaptive Immune Receptor Repertoire Sequencing, AIRR-Seq) emprega tecnologias de sequenciamento de alto rendimento (do inglês, High Throughput Sequencing, HTS) para estudar e compreender aspectos e dinâmicas de respostas adaptativa frente à diferentes estímulos antigênicos. Nessa etapa do minicurso, focaremos no AIRR-Seq de BCR/anticorpos.

Informações Gerais

  • Acesso ao Google Drive aqui.

Softwares Necessários:

  • Conda: Conda consiste em um sistema de administração de pacotes e ambientes, de codigo aberto, que possibilita a instalação e fácil execução de pacotes de softwares e suas respectivas dependências.
  • MiXCR: MiXCR é uma ferramenta rápida e precisa para análise de sequenciamento de receptores de linfócitos B e T.
  • SRA Toolkit: O SRA toolkit é uma coleção de ferramentas para acesso, coleta e processamento do banco de dados Sequencing Read Archives (SRA).
  • Seqtk: O seqtk é uma ferramenta para processamento de sequencias em formato FASTA ou FASTQ.
  • VDJviz: VDJviz é um visualizador browser de dados de AIRR-Seq.

Jupyter Lab:

O JupyterLab consiste em um ambiente de desenvolvimento integrado (IDE) web. A partir do JupyterLab pode-se executar interfaces apropriadas para condução de workflows em areas como ciências de dados e computação científica. Para fins de minicurso, iremos utilizar o JupyterLab para condução das análises práticas de AIRR-Seq. Para se ter acesso ao ambiente para condução das análises clique aqui.

Criação do ambiente Conda

  • Deverá ser criado um ambiente específico, onde as ferramentas serão instaladas:
mkdir airr_seq # Criar um diretório específico
cd airr_seq # Entra no diretório recém criado
conda activate --name {nome_ambiente} python=3 -y # Cria o ambiente
  • Para entrar no ambiente:
conda activate {nome_ambiente}
  • Para instalar os softwares necessários:
conda install -c imperial-college-research-computing mixcr -y
conda install -c bioconda sra-tools seqtk -y

Coleta dos dados

Os dados a serem analisados são oriundos do trabalho de GALSON et al., 2020. O banco de dados SRA do NCBI será acessado para coleta dos dados de sequenciamento. O número de acesso do projeto é SRX8505845 e será analisado apenas a amostra SRR11961719 para fins de exemplificação. A amostra em questão é de um homem, infectado com SARS-CoV-2, de 37.2 anos de idade e caucasiano. Encontrava-se em recuperação após ser internado em UTI e apresentava melhora no quadro clínico.

  • O download da amostra é descrita a seguir:
fastq-dump --split-files SRR11961719
  • Uma vez baixado, se obterá apenas um subconjunto de 10000 reads dessa amostra total:
seqtk sample -s100 SRR11961719_1.fastq 10000 > SRR11961719_subreads_1.fastq
seqtk sample -s100 SRR11961719_2.fastq 10000 > SRR11961719_subreads_2.fastq
  • A coleta de apenas um porção aleatória da amostra em questão tem dois propósitos principais:
  1. Viabilizar as análises dos dados em um tempo razoável para fins de minicurso.
  2. A ferramenta de visualização, VDJviz, impõe um volume de dados máximo para se carregar na plataforma.

Execução da análise

Para analisar a amostra recém obtida, será executado o software MiXCR. Dentro do diretório criado anteriormente, onde a amostra encontra-se, execute na linha de comando:

mixcr analyze amplicon --species hs \
        --starting-material rna \
        --5-end v-primers \
        --3-end j-primers \
        --adapters adapters-present \
        --receptor-type IGH \
       SRR11961719_subreads_1.fastq SRR11961719_subreads_2.fastq analysis

Diversos arquivos serão gerados. Todavia, o arquivo de interesse será analysis.clonotype.IGH.txt.

Visualização dos dados

O arquivo analysis.clonotype.IGH.txt será visualizado utilizando a ferramenta VDJviz.

  • ATENÇÃO: O VDJviz é uma ferramente de demonstração (demo). Na prática, uma fez com que o cadastro seja feito, cada aluno terá acesso à ferramenta algumas poucas vezes. Por isso, certifique-se de que o arquivo analysis.clonotype.IGH.txt seja obtido adequadamente antes de se realizar o cadastro no VDJviz. Peço desculpas quanto à essa questão, todavia essa ferramenta web foi a mais simples e acessível que pudemos encontrar para visualizar os dados obtidos anteriormente. Instalar o VDJviz como servidor local pode ser feito e mais informações são encontrada aqui.

Análise de expressão diferencial com RNA-seq

A partir do sequênciamento de RNA utilizando sequenciadores de próxima geração (NGS), como o Illumina, podemos fazer diversas análises relacionadas com a expressão gênica, que poderão fornecer informações sobre o estado e a dinâmica das células. Em imunologia pode servir de base para entender os mecanismos da resposta imune. Nessa etapa do minicurso veremos um pouco como são feitas as análises de RNA-seq no programa R.

Preparação do ambiente no Jupyter

  • No terminal do jupyter digite:
git clone https://github.com/dimitrisokolowskei/minicurso_ufpel.git # Baixar repositório
chmod u+x minicurso_ufpl/prep_jupyter.sh # Tornar arquivo executácel
.minicurso_ufpl/prep_jupyter.sh # Executar arquivo

Exemplos de análises

Poderão ser encontrados no arquivo do Drive, através do arquivo AnáliseRna-seq.ipynb que precisará ser baixado e aberto no ambiente jupyter.